Sécurité microbiologique de la viande de bœuf

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Comprendre comment les souches Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) persistent dans le tube digestif des bovins

Les souches EHEC sont hébergées dans le tractus digestif des bovins et peuvent contaminer accidentellement la viande de bœuf au moment de l’abattage. Il est important de savoir comment ces souches se multiplient chez l’animal afin de pouvoir combattre leur prolifération et dissémination.

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INTRODUCTION

Les Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) sont responsables de toxi-infections alimentaires pouvant aller d’une diarrhée aqueuse bénigne jusqu’à des maladies beaucoup plus graves telles que le syndrome hémolytique et urémique (à l’origine d’une atteinte rénale sévère) chez l‘enfant ou le purpura thrombotique thrombocytopénique (pouvant être à l’origine d’une grave atteinte du système nerveux central) chez l’adulte. Les souches EHEC de sérotype O157:H7 font partie des souches les plus virulentes et sont responsables d’une grande partie des atteintes sévères. Les EHEC produisent des toxines (shigatoxines) dans l’intestin humain, qui passent dans la circulation sanguine pour atteindre les cellules endothéliales, en particulier du côlon, du rein ou de l’encéphale, d’où les principales lésions rencontrées chez le malade.

Le réservoir naturel des principales souches EHEC est le tractus digestif des ruminants domestiques, principalement les bovins, qui sont porteurs sains. Les souches pathogènes sont disséminées par excrétion dans les matières fécales et peuvent ensuite contaminer, directement ou indirectement, différentes denrées alimentaires (viande, lait, fromage, légumes). Les principaux aliments à risque sont par ordre d’importance: 1) les viandes de bœuf hachées consommées crues ou insuffisamment cuites, 2) le lait cru ou les produits au lait cru et 3) certains légumes ou fruits consommés crus ou encore certains jus de fruit non pasteurisés (jus de pommes). En France, l’agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail (Anses) a recensé 22 cas de syndrome hémolytique et urémique après ingestion de viande hachée de bœuf contaminée par des EHEC O157:H7 entre 2011 et 2012 (1). En France également, entre 0.2% et 0.48% des bovins à l’abattoir sont porteurs de souches E. coli O157 dans leur tube digestif (1) et jusqu’à 4,5% des jeunes bovins peuvent être porteurs de souches EHEC potentielles de différents sérogroupes (2). Même si les toxi-infections à  EHEC ne sont pas souvent à l’origine d’épidémies de grande ampleur, elles sont cependant considérées comme une préoccupation de santé publique en raison de la gravité des syndromes engendrés. Il est important de mettre en place des stratégies permettant de limiter le portage sain par les ruminants, et par conséquent l’excrétion fécale de ces bactéries pathogènes. Ces stratégies devraient permettre de limiter la propagation des souches EHEC dans la chaîne alimentaire de l'homme.

 

I. STRATEGIES DE LIMITATION DU PORTAGE

En laboratoire, différentes souches bactériennes (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus. crispatus, Propionibacterium freudenreichii voire même certaines souches non pathogènes d’Escherichia coli) ont été proposées pour limiter le portage des souches pathogènes par l’animal. Une inhibition de la croissance des EHEC par ces souches antagonistes (probiotiques) a pu ainsi être mise en évidence in vitro. Sur le terrain, les souches antagonistes sont évaluées sur la réduction de l’excrétion fécale de souches EHEC naturellement présentes chez l’animal. Cependant, l’interprétation des résultats reste très difficile du fait de la grande variabilité existant entre les animaux.
Les mécanismes d’action de ces souches antagonistes sont encore très mal connus. Plusieurs hypothèses ont été émises pour expliquer leur capacité à inhiber la croissance des EHEC : 1) production d’acides organiques (lactique, acétique, propionique) au cours de la fermentation ayant pour conséquence une acidification du milieu intestinal 2) production de peptides soit antimicrobiens (type antibiotique) soit entrant en compétition avec les EHEC pour adhérer à la paroi intestinale et 3) modulation de l’équilibre de la flore digestive autochtone dans un sens défavorable à l’implantation des EHEC.
Des stratégies nutritionnelles peuvent aussi être envisagées. Chez le mammifère, il existe une très forte compétition nutritionnelle parmi les bactéries constituant le microbiote intestinal (ou flore intestinale). On dénombre jusqu’à 1014 bactéries au sein du microbiote intestinal composé de plus de 1 000 espèces différentes de microorganismes. Chaque espèce bactérienne doit pouvoir utiliser un ou quelques nutriments plus efficacement que les autres espèces microbiennes afin de pouvoir se maintenir dans cet écosystème très complexe. D’une manière générale, les bactéries doivent disposer de sources de carbone, d’azote et d’énergie pour se multiplier. Dans le tube digestif du ruminant, ces nutriments proviennent de la ration alimentaire transitant dans l’intestin mais également de produits déversés par l’animal dans son tube digestif.  Par ailleurs, le renouvellement naturel des cellules de l’animal s’accompagne de la mort et de la destruction des cellules constituant la paroi intestinale. Les molécules entrant dans la composition de ces cellules sont alors déversées dans la lumière intestinale et sont ensuite utilisées comme nutriments par les bactéries du microbiote.

 

II. RECHERCHE AU SEIN DE L’UNITE MICROBIOLOGIE DE L’INRA DE CLERMONT-FERRAND-THEIX

Nous étudions les nutriments présents dans le tube digestif du bovin et pouvant être utilisés par les souches EHEC pour assurer leur multiplication. Dans le rumen, les EHEC résistent mal aux conditions spécifiques de ce compartiment digestif (anaérobiose stricte) (3, 4) mais les bactéries qui franchissent cette barrière rencontrent des conditions plus favorables dans l’intestin grêle (5, 6). Cependant, la composition en nutriments du contenu de l’intestin grêle est très peu connue. Avant de mettre en place des stratégies nutritionnelles afin de limiter le portage des EHEC par le ruminant, des recherches plus fondamentales sont nécessaires afin de connaître la composition du contenu de l’intestin grêle d’une part et les voies métaboliques préférentiellement utilisées par les EHEC dans ce compartiment d’autre part. Ces dernières années nous avons pu mettre en évidence que 1) les sucres entrant dans la composition du mucus recouvrant l’intestin grêle du bovin constituent d’importantes sources de carbone pour les EHEC et 2) l’éthanolamine est une source d’azote spécifique des EHEC dans ce compartiment digestif.

 

III. SOURCE DE CARBONE DANS DES CONTENUS DIGESTIFS BOVINS.

D’une manière générale, les sources de carbone préférées des souches Escherichia coli sont les sucres simples, en particulier le glucose. La cellulose et l’amidon, représentant une part importante de la ration alimentaire du ruminant, sont des polymères de glucose. Cependant, les souches E. coli ne possèdent pas l’équipement enzymatique leur permettant de dégrader ces polymères pour utiliser le glucose les constituant et le glucose sous forme libre n’est retrouvé qu’en très faible quantité dans les contenus d’intestin grêle de bovins (63 mg L-1) (6).
La couche de mucus recouvrant la paroi intestinale représente une source de carbone alternative pour les microorganismes du tube digestif des mammifères. Le mucus, composé de longs filaments d’oligosaccharides fixés à des molécules d’acides aminés, forme un réseau tridimensionnel tapissant la paroi intestinale (7). Cette couche de mucus a pour fonction de 1) lubrifier la paroi intestinale afin de favoriser le transit intestinal et 2) protéger la paroi de l’intestin des sécrétions digestives et des bactéries pathogènes (8). Au cours du renouvellement cellulaire, 25% des cellules intestinales et des structures qui les recouvrent, sont quotidiennement déversés dans la lumière intestinale. Les oligosaccharides constituant la couche de mucus sont ainsi libérés dans le tractus digestif. Les bactéries anaérobies du microbiote intestinal du ruminant sont capables d’hydrolyser ces oligosaccharides et de libérer les sucres simples dans la lumière intestinale. Six sucres majeurs (galactose, N-acétyl-glucosamine, N-acétyl-galactosamine, fucose, mannose et acide N-acétyl neuraminique) constituent la partie glucidique du mucus de l’intestin grêle du bovin (7). Le mucus intestinal est ainsi une source de nutriments constamment renouvelée et facilement accessible aux bactéries du tube digestif (Fig. 1).

Figure 1 : Les sucres du mucus sont déversés dans la lumière intestinale

fig1 340

Les études menées au laboratoire ont été réalisées à partir de contenus digestifs de vaches prélevés à l’abattoir expérimental du Centre INRA de Clermont-Ferrand-Theix. L’intestin grêle des animaux a été isolé de l’ensemble du tube digestif et son contenu a été prélevé sous une atmosphère d’azote (anaérobiose) afin de préserver la viabilité du microbiote intestinal. Une souche EHEC a ensuite été incubée dans des échantillons de contenus d’intestin bovins (CIB) et la disparition des sucres a été analysée. Nous avons ainsi détecté et quantifié les six sucres majeurs du mucus dans des échantillons de CIB, le galactose (257 mg L-1) et le N-acétyl-glucosamine (197 mg L-1) étant les plus abondants. La souche EHEC assimile rapidement et simultanément l’ensemble des sucres libérés à partir du mucus mais le plus important est que chacun des six sucres est consommé plus rapidement par la souche EHEC que par les bactéries du microbiote intestinal (Fig. 2). Ces résultats mettent ainsi en évidence la grande efficacité d’assimilation des sucres du mucus par la souche EHEC. En suivant l’expression de certains gènes, nous avons également pu identifier les mécanismes enzymatiques et les voies métaboliques activés par la bactérie pour dégrader ces sucres et les utiliser comme source de carbone (6). Nous avons ensuite construit, par manipulation génétique de la souche EHEC, des mutants incapables d’assimiler chacun des 6 sucres et nous avons incubé chacun de ces mutants dans des échantillons de CIB en présence de la souche EHEC non-mutée. Nous avons alors observé un déficit de croissance important pour les souches mutées incapables d’assimiler 4 des 6 sucres (mannose, N-acétyl-glucosamine, acide N-acétyl neuraminique, galactose) (un exemple de culture en compétition est représenté sur la Fig. 3). Ces résultats confirment l’importance de ces quatre sucres pour la croissance des EHEC dans le CIB.

Figure 2 : La souche EHEC consomme les sucres du mucus de l’intestin grêle plus efficacement
que les bactéries du microbiote intestinal

fig2 340

Figure 3 : La souche EHEC doit assimiler le mannose pour bénéficier d’une croissance optimale
dans le contenu intestinal bovin.

fig3 340

Les souches EHEC sont retrouvées dans le tube digestif (TD) des bovins à des concentrations de l’ordre de 103 à 104 bactéries par gramme de contenu intestinal. Elles sont donc ultra minoritaires au sein des bactéries du microbiote de l’intestin grêle de l’animal (108 à 109 bactéries par g de contenu intestinal) qui sont dans leur grande majorité capables d’assimiler des sucres sous forme de polymères. Il semble ainsi que les souches EHEC se soient spécialisées dans une assimilation efficace des sucres simples issus du mucus alors que les bactéries du microbiote intestinal consomment préférentiellement les polymères  de ces sucres.

 

IV. SOURCE D’AZOTE DANS DES CONTENUS DIGESTIFS BOVINS

Nous avons également montré que l’utilisation de l’éthanolamine (EA) comme source d'azote est requise pour un développement optimal des EHEC dans l’intestin grêle du ruminant. L’EA est une petite molécule présente dans le phosphatidyléthanolamine, un des composants majeurs de la membrane des cellules à la fois de l’animal, des plantes et des bactéries. Ce composé est libéré dans le tractus digestif lors de la destruction des cellules végétales provenant de l’alimentation  ou des bactéries du microbiote intestinal.  
Pour démontrer l’importance de l’EA, nous avons bloqué la voie métabolique d’assimilation de cette molécule chez la souche EHEC en mutant par génie génétique le gène codant l’enzyme qui permet la libération d’azote à partie d’éthanolamine (Fig. 4). De la même manière que pour les sucres du mucus, nous avons incubé la souche mutée et la souche non mutée  dans des échantillons de CIB et nous avons observé un déficit de croissance pour la souche mutée incapable d’utiliser l’EA comme source d’azote.

Figure 4 : L’azote sous forme d’ammoniaque est libéré à partir d’une molécule d’éthanolamine

fig4 340

Les souches EHEC semblent particulièrement bien adaptées à une utilisation spécifique de l’EA dans l’intestin grêle du bovin :

Figure 5 : L’éthanolamine est majoritairement consommé par la souche EHEC

fig5 340

Figure 6 : L’intestin grêle est le compartiment digestif contenant la quantité d’EA la plus importante

fig6 340

 

CONCLUSION

Une diminution du développement des EHEC peut être envisagée en complémentant l’alimentation des animaux par des probiotiques ayant une forte affinité pour les nutriments favorisant la multiplication des EHEC dans le tube digestif  de l’animal. Nos travaux ont démontré que les souches EHEC, ultra minoritaires au sein du microbiote de l’intestin grêle des bovins, se sont spécialisées dans une utilisation rapide et efficace des sucres simples issus du mucus comme sources de carbone ainsi que de l’éthanolamine comme source d’azote. Ces différents nutriments constituent une niche écologique pour les souches EHEC et favorisent leur persistance dans l’intestin du ruminant.
Des études devront être menées pour identifier des souches probiotiques (par exemple des levures ou des bactéries lactiques) entrant en compétition avec les EHEC pour ces composés et qui ajoutées en grand nombre dans l’alimentation des bovins priveront les souches EHEC de sources de nutriments importantes. Cette compétition nutritionnelle pourra alors compromettre la survie des EHEC dans leur réservoir naturel et par conséquent réduire la contamination des aliments.

 

Bibliographie

1] Loukiadis E, Callon H, Mazuy-Cruchadet C, Vallet V, Bidaud C, Ferré F, Giuliani L, Bouteiller L, Pihier N, Danan C. 2012. Surveillance des E.coli producteurs de shigatoxines (STEC) dans les denrées alimentaires en France (2005-2011). Bulletin épidémiologique - Santé animale, alimentation n°55. Agence nationale de sécurité sanitaire alimentation, de l’environnement et du  travail (ANSES).
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6] Bertin Y, Chaucheyras-Durand F, Robbe-Masselot C, Durand A, de la Foye A, Harel J, Cohen PS, Conway T, Forano E, Martin C. 2013. Carbohydrate utilization by enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in bovine intestinal content. Environ Microbiol. 15(2), 610-622.
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